扶正化瘀方对肝纤维化大鼠间质性基质金属蛋白酶活性的影响

 

崔红燕  姜哲洁 刘成  刘成海

[摘要] 为探讨扶正化瘀方影响间质性基质金属蛋白酶活性的抗肝纤维化作用机制，采用二甲基亚硝胺腹腔注射4w诱导大鼠肝纤维化模型，随机分为正常组、模型组与治疗组；治疗组成模后以扶正化瘀方灌胃4w，模型组予以等量生理盐水；检测血清肝功能与肝组织羟脯氨酸含量，蛋白印迹法分析肝组织α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶-13和纤溶酶原激活物抑制剂-1蛋白表达，同位素标记底物凝胶法检测间质性基质金属蛋白酶活性。结果：扶正化瘀方显著改善模型大鼠肝功能与肝组织胶原沉积；明显降低肝组织羟脯氨酸含量，抑制肝组织α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白表达；对基质金属蛋白酶-13蛋白表达无影响，但明显降低PAI-1蛋白表达，促进间质性基质金属蛋白酶活性。提示扶正化瘀方可促进肝纤维化大鼠间质性基质金属蛋白酶酶原的激活与活性水平，该作用是扶正化瘀方逆转肝纤维化的重要机制之一。

肝纤维化以肝脏细胞外基质代谢失衡，生成超过降解，并大量沉积于肝组织为特征。基质金属蛋白酶降解ECM，在肝纤维化形成与逆转的病理生理中具有重要作用。既往研究表明抗肝纤维化新药扶正化瘀方有良好的抗肝纤维化作用，并可促进肝窦毛细血管化的逆转，但是对其影响MMP_S的逆转肝纤维化作用机制尚不清楚。因此，本研究采用二甲基亚硝胺大鼠肝纤维化模型，探讨扶正化瘀方影响间质性MMP_S蛋白、活性和酶原活化因子而抗肝纤维化的作用机制。

 

材料与方法

1．1 材料

1．1．1 动物  采用Wistar雄性大鼠37只，清洁级，体重（150±10）g，中科院上海实验动物中心提供。

1．1．2 药物  扶正化瘀方由丹参、桃仁、虫草菌丝、松花粉等组成，由上海现代中医药技术发展公司提供，制备成含生药为276mg/ml的流浸膏。

1．1．3试剂  DMN，购自日本东京化成工业株式会社；羟脯氨酸标准品，分析纯，日本ナカテイテスケ株式会社产品；小鼠抗人α-SMA单克隆抗体，DAKO公司产品；兔抗小鼠Ⅰ型胶原多克隆抗体，Calbiochem公司产品；小鼠抗大鼠MMP-13单克隆抗体，Neosepker公司产品；小鼠抗人纤溶酶原激活物抑制剂单克隆抗体，Oncogene公司产品；辣根过氧化物标记驴抗兔抗体和辣根过氧化物标记驴抗小鼠抗体，APB公司产品；纯化IV型胶原酶，分析纯，Sigam公司产品。

1．2 方法

1．2．1 模型制备  大鼠按0.5%DMN（1：199四生理盐水稀释）2ml·kg^-1大鼠体重的剂量腹腔注射，1次/d，每周连续3d，共4周，第1周注射2/3量。正常组给予等量生理盐水。

1．2．2 分组与给药Wistar雄性大鼠，分为正常组（5只）、模型组（18只）和治疗组（14只）。大鼠4周造模成型后，治疗组以扶正化瘀方15ml·kg^-1大鼠体重灌胃，1次/d，共4周。正常组和模型组灌以等量生理盐水。疗程结束后，以2%戊巴比妥钠腹腔注射（3ml·kg^-1体重）麻醉，开腹，经后腔静脉采血，分离血清；自肝左叶取小块肝组织置中性甲醛缓冲液固定，部分肝组织置于-70℃保存。

1．2．3 观察项目 ①肝脏组织病理学观察：HE染色和天狼猩红胶原染色，光镜观察；②肝功能指标：血清丙氨酸氨基转移酶活性，赖氏法；血清门冬氨酸基转移酶活性，比色法；血清白蛋白含量，溴甲酚绿法；③肝组织Hyp含量：Jamall氏法。④肝组织α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白、基质金属蛋白酶-13、PAI-1 蛋白表达水平：蛋白印迹法；⑤肝组织间质性MMPs活性：凝胶法。

1．3 统计学方法

计算机统计软件SPSS10.0中的ANOVA程序进行单因素方差分析，LSD程序进行两组比较，P<0.05为差异具有显著性意义。

                              结果

2．1 扶正化瘀方对模型大鼠肝脏炎症与胶原沉积的影响

模型大鼠肝脏组织炎性病变明显，汇管区增宽，汇管区与纤维间隔内有单核细胞和淋巴细胞等浸润，并可见到再生的肝细胞。与模型组相比，扶正化瘀方用药后，肝细胞变性坏死和炎性细胞浸润程度均明显减轻，肝窦壁细胞增生和肝窦扭曲、闭塞不明显。

模型大鼠肝组织胶原纤维明显增生，部分大鼠肝组织可见大量菲薄的纤维间隔，分割包绕肝组织形成完整的假小叶。扶正化瘀方治疗组大鼠肝组织胶原纤维增生较模型组显著减轻。

2．2 扶正化瘀方对模型大鼠肝功能的影响

扶正化瘀方治疗组与模型组比较，血清ALT活性有下降趋势，AST活性显著下降，而TBil含量和Alb水平变化不明显。（见表1）

2．3 扶正化瘀方对模型大鼠Hyp含量的影响

模型组大鼠肝组织Hyp含量明显升高。扶正化瘀方能使模型大鼠肝组织增高的Hyp含量明显降低。（见表1）

2．4 扶正化瘀方对大鼠α-SMA蛋白表达的影响

模型大鼠α-SMA蛋白表达水平较正常大鼠明显升高。扶正化瘀方治疗组表达明显下降。

2．5 扶正化瘀方对模型大鼠Ⅰ型胶原蛋白表达的影响

模型组较正常组Ⅰ型胶原蛋白水平升高约2倍，扶正化瘀方用药后肝组织Ⅰ型胶原蛋白表达显著降低。

2．6 扶正化瘀方对模型大鼠MMP-13蛋白表达影响

模型组MMP-13蛋白表达水平较正常组明显升高。扶正化瘀方用药后，大鼠肝组织MMP-13蛋白表达无明显变化。

表1 扶正化瘀方对模型大鼠肝功能和Hyp含量影响（±s）

*与正常组比较，P<0.05；#与正常组比较，P<0.05。

2．7 扶正化瘀方对模型大鼠肝组织间质性MMPs活性影响

模型组与正常组相比，大鼠肝组织间质性MMPs活性明显升高。扶正化瘀方则使肝组织间质性MMPs活性升高更为明显，但与模型组比较无统计学意义。（见表2）

表2  扶正化瘀方对肝组织间质性MMP_S活性影响（±s）

*与正常组比较，P<0.05

2．8 扶正化瘀方对肝组织PAI-1蛋白表达影响

模型组较正常组PAI-1蛋白表达明显升高。药物治疗组肝组织PAI-1蛋白表达显著降低，约为模型组的1/2。

 

讨 论

肝纤维化是诸多慢性肝病的共同病理特点，可见于临床慢性肝炎与肝硬化等疾病，其病变较久，病程较长，临床表现多有“瘀”与“虚”的特点，中医基本病机表现为瘀血阻络、肝肾虚损及湿热邪毒未清。因此，扶正补虚、活血化瘀是肝纤维化治疗常用法则。扶正化瘀方是抗肝纤维化国家三类中药新药，有丹参、桃仁、虫草菌丝等组成。方中丹参、桃仁活血化瘀，虫草益精补虚。诸药合用，扶正化瘀，攻补兼施，使正气得复，瘀滞得去，肝络通畅。研究证实该方有良好的抗肝纤维化疗效，具有多途径、多环节的作用特点。

肝纤维化主要是ECM在肝脏中大量生成与沉积，其中尤其重要的是Ⅰ型胶原的沉积。肝星状细胞（HSC）是肝纤维化形成的细胞学基础。肝损伤后HSC活化，发生形态与功能变化，合成与分泌大量ECM。α-SMA则是HSC活化的重要标志物。本实验中，模型组α-SMA与Ⅰ型胶原表达明显升高，肝组织Hyp含量明显增加；肝组织纤维增生并分割肝小叶形成假小叶。应用扶正化瘀方后上述病理学观察明显得到改善，表明药物通过抑制HSC的活化减少Ⅰ型胶原的表达，从而减轻肝纤维化。

MMPs是参与ECM降解代谢的主要酶家族，在肝纤维化的发生、发展及逆转中发挥着重要作用，尤其间质性与基底膜性MMP作用员为重要。研究发现，MMP-1是人类主要的间质性MMPs，而MMP-13是啮齿类动物的间质性MMPs。肝纤维化形成过程中，间质性MMP变化尚有争议，这可能由于间质性MMPs酶活性检测方法复杂，影响因素较多。本实验应用蛋白印迹法研究表明，模型组MMP-13蛋白表达明显升高；同时，同位素标记凝胶底物法也显示间质性MMP活性升高。这除了与炎症反应有关，也可能是机体对纤维增生的一种反馈性调节机制，以降解过度增生的ECM。但由于ECM增生大于降解，其结果表现为增生沉积与纤维化形成。扶正化瘀方用药后对间质性MMPs蛋白表达无明显影响，但可进一步升高间质性MMP活性，促进已经沉积的间质性胶原降解，发挥其抗肝纤维化的作用。

MMPs以无活性的酶原形式分泌，需激活后才能发挥作用，因此酶原激活是MMPs活性的重要调节环节。MMPsl酶原的激活多发生在细胞表面，有多个途径，共同构成一个复杂的酶原激活系统，其中纤溶酶系统通过级联放大方式在MMPs酶原活化中发挥重要作用。纤溶酶系统有纤溶酶、纤溶酶原激活物、MMP-1等组成。纤溶酶是一种丝氨酸蛋白酶，由纤溶酶原经纤溶酶原激活物催化生成。在组织损伤修复与纤维化过程中，纤溶系统从两个方面发挥作用：其一，纤溶酶是一种作用广泛的丝氨酸蛋白酶，可直接降解多种ECM成分。其二，纤溶酶可以部分激活MMP-1和MMP-3，进而导致大多数MMPs的完全活化和超活化。PAI-1则通过抑制纤溶酶激活物与其受体的结合，从而抑制纤溶酶原与MMPs酶原的活化。同时PAI-1又是转化生长因子的重要效应基因，肝纤维化时转化生长因子表达增加，可明显上调HSC的PAI-1合成。有研究表明，抑制PAI-1表达可起到防治纤维化作用。本实验发现，正常大鼠肝组织PAI-1表达极低，模型大鼠PAI-1表达明显升高，可能抑制了MMPs酶原的活化，使MMPs活化相对不足，促进ECM沉积。而扶正化瘀方能明显抑制PAI-1的表达，从而促进纤溶酶及溶基质素的活化，进一步促进MMPs酶原活化，且纤溶酶自身即具有直接降解ECM的作用，因此，扶正化瘀方在PA1-1蛋白表达这个环节也可以发挥其抗肝纤维化的作用。（上海中医药大学学报，2003，3）