扶正化瘀方影响肝脏胶原生成的拆方配伍研究

扶正化瘀方影响肝脏胶原生成的拆方配伍研究

刘成海王晓玲王臻楠刘平顾宏图胡义扬

[摘要] 将扶正化瘀方拆分为扶正组、化瘀组、虫草组、丹参组及丹参加虫草组。制备各组含药血清，分离培养大鼠肝星状细胞，观察含药血清对培养星状细胞增殖活化、I胶原蛋白及其mRNA表达的影响。复制二甲基亚硝胺大鼠肝纤维化模型。以全方及拆方组治疗，观察模型大鼠肝脏羟脯氨酸（Hyp）含量与胶原沉积的变化。结果各组含药血清均可抑制星状细胞的增殖和活化，其中化瘀药效果最明显；各组合药血清均可抑制星状细胞I胶原mRNA及其蛋白的生成，以扶正组效果最佳。对DMN模型肝纤维化的治疗中，以全方组降低肝组织Hyp含量与胶原沉积最为明显，化瘀药与扶正药配伍后减轻胶原生成作用增强，全方具有较好的综合效果。说明扶正化瘀方有较好的抑制星状细胞增殖与胶原基因表达作用，是该方抗肝纤维化作用的重要机理。其扶正药重在抑制胶原生成，化瘀药长于抑制星状细胞增殖，而全方具有综合效果。

炎症与纤维化是慢性肝炎的两大病理特征，抗肝纤维化是防治慢性肝炎的重要治疗措施。扶正化瘀319方是我所研制的抗肝纤维化中药复方，长期的临床观察和实验研究均表明有良好的抗肝纤维化作用。该方主要由益精补虚与活血化瘀两类药物组成，为了研究该方组成药物的配伍作用机理，我们将该方以主要治法、主要药物两个层次拆方，复制二甲基亚硝胺（DMN）大鼠肝纤维化模型，分离培养肝纤维化胶原生成关键细胞—肝星状细胞，观察了全方与各拆方组对模型大鼠肝脏胶原生成与沉积，全方与各拆方组含药血清对培养肝星状细胞活化增殖与胶原基因表达等的影响。

材料与方法

1．1 材料

1．1．1 动物：Wistar雄性大鼠，SPF级，由上海中医药大学动物实验中心提供。

1．1．2 药物：扶正化瘀319方由虫草菌丝、丹参、桃仁、松黄、七叶胆等组成，上海中华制药厂协助制成流浸膏，每克浸膏含生药8.16g。扶正组由虫草菌丝、松黄等组成，化瘀组由丹参、桃仁等组成，丹参组、虫草菌丝组、丹参加虫草菌丝组。各拆方组中的药物用量与全方组中单味药用量一致。

1．1．3 主要试剂：DMN，美国Aceros公司产品；羟脯氨酸标准品（Hyp）为日本ナヌライウスク（NACALA1）株式会社产品；199培养基（M199）购自Gibco BRL公司；Nycojenz、鼠尾I型胶原购自Sigma公司；Pronase E购自Merck公司；兔抗鼠I型胶原购自Calbiochem公司；单克隆小鼠抗人α-SMA抗体购自Dako公司。

1．1．4 引物：引物设计按参考文献。

1．2 方法

1．2．1 肝星状细胞的分离及培养：按本所常规方法进行，即先以D-Hank液原位灌流肝脏，继以0.1%链酶蛋白酶E、0.015%胶原酶原位消化肝脏。肝脏细胞悬液红12%Nycojenz 1450r、4℃、20分钟离心，获取肝星状细胞。台盼蓝染色细胞活力为98%，细胞鉴定依据相差显微镜下富含脂滴的细胞形态与结蛋白免疫细胞化学染色阳性，细胞纯度为90%，细胞得率为（2~5）×10⁷个/肝。细胞以含10%小牛血清的M199培养，原代细胞长满单层后，传一代培养。

1．2．2 药物血清的制备：根据我们既往方法，以3.75g生药/60kg大鼠体重（相当于60kg临床病人等体重10倍量）灌胃，间隔2小时2次给药，再1小时后，自后腔静脉采血，离心分离血清。对照组给予生理盐水。56℃、30分钟灭活。

1．2．3 模型制备：参照A1akkok方法。生理盐水稀释DMN为0.05% 浓度，以10µ1DMN/kg大鼠体重的剂量，腹腔注射，每日1次，每周连续3天，共4周。

1．2．4 培养细胞增殖试验：[³H]TdR掺入法，24孔板传一代培养的肝星状细胞长至近单层时，以含10%（v/v）药物血清的M199温育24小时，掺入[³H]TdR，24小时后收集细胞，测定cpm值。

1．2．5 细胞培养上清I型胶原含量测定：参照参考文献方法，传一代肝星状细胞经药物血清温育48小时后，分别收集培养上清及细胞层。ELISA法测定上清中I型胶原含量，即以不同浓度I型胶原标准品及样品分别包被酶标板，先以I型胶原抗体结合，继之IgG-HRP孵育，邻苯二胺显色，酶标仪上读取OD₄₉₂值，随机软件计算标准曲线与样本含量。测定细胞层总蛋白。

1．2．6 细胞α-SMA　染色；药物温育同上时间后，吸弃上清，细胞层免疫细胞化学PAP法染色α-SMA，MPIAS-500图象分析系统分析阳性染色光密度值。

1．2．7 培养细胞I型前胶原mRNA表达检测：方法略。

1．2．8 病理染色：肝组织经中性甲醛缓冲液固定，石蜡包埋，丽春红胶原染色，图象分析阳性染色光密度值。

1．2．9 肝组织Hyp含量测定：采用Jamall法。

1．2．10 统计方法：双侧t检验

结果

2．1 含药血清对培养肝星状细胞增殖和活化的影响：

　与对照组相比，全方组及其拆方各组肝星状细胞内[³H]TdR掺入量和α-SMA阳性光密度均显著降低，且均以化瘀组最低。见表1。

表1 含药血清对培养肝星状细胞增殖和活化的影响（±s）

分组	n	[³H]TdR掺入（cpm/well）	α-SMA阳性光密度
对照组	4	10024.63±1975.22	19.35±10.37
全方组	4	5329.23±737.14^*	82.67±7.04^*
扶正组	4	6381.07±1367.07^*	65.32±3.64^*
化瘀组	4	2796.00±910.67^*	41.01±9.16^*
虫草组	4	4605.65±964.58^*	68.20±8.19^*
丹参组	4	4245.20±1092.90^*	47.49±6.44^*
丹参加虫草组	4	4642.55±917.15^*	77.99±9.93^*

与对照组比较，*P<0.05

表2 含药血清对肝星状细胞I型胶原分泌与mRNA表达的影响（±S）

		胶原含量	mRNA水平
分组	n	（ng/ug细胞层蛋白）	（%CAPDH/COLIA2）
对照组	5	87.79±15.34	94.62±10.23
全方组	5	58.61±8.57^*	78.13±9.42^*
扶正组	5	19.47±4.06^*	59.24±8.90^*
化瘀组	5	46.52±9.60^*	79.15±8.96^*
虫草组	5	61.21±11.12^*	76.62±10.98^*
丹参组	5	37.46±11.24^*	79.83±9.94^*
丹参加虫草组	5	66.61±11.78^*	64.51±10.03^*

与对照组比较，*P<0.05

2．2 含药血清对培养肝星状细胞I型胶原分泌与mRNA表达的影响：

全方组及其拆方各组I型胶原含量及其mRNA表达均显著低于对照血清组，均以扶正组最低，见表2。

2．3 药物对模型大鼠肝脏Hyp含量与胶原沉积的影响：

模型组肝脏Hyp含量与胶原沉积较正常大鼠明显增加，而全方组、扶正组与丹参加虫草组有依次强弱的明显抑制作用。见表3。

表3 药物对各组大鼠肝脏Hyp含量与胶原沉积的影响（±s）

分组	N	Hyp(µg/g肝组织)	胶原染色光密度
正常组	6	283.7±43.2^*	0.3317±0.0697^*
模型组	9	453.2±30.6	1.3984±0.2459
全方组	9	312.2±46.1^*	0.3763±0.0232^*
扶正组	9	352.3±52.4^*	0.7549±0.1305^*
化瘀组	9	379.5±80.3^*	1.1159±0.2944
丹参加虫草组	9	359.9±41.8^*	0.7168±0.0852^*

与对照组比较，*P<0.05

讨论

肝纤维化是多种慢性肝病发展至肝硬化的必经病理过程，存在于诸多慢性肝病中。这些疾病类似于中医的“癓积”，往往迁延缠绵，具有正气耗损、瘀血阻络等病理变化。扶正化瘀方立足于“癓积”的“血瘀邪盛”和“精亏正虚”这两个关键因素，采用丹参、桃仁等活血化瘀，虫草菌丝、松黄等益精补虚，临床观察与实验研究均表明该方有良好的抗纤维化作用。

肝星状细胞受肝损伤刺激后，发生“活性”，表型上转化为肌成纤维样细胞，表达α-SMA，脂滴减少，功能上一是细胞分裂增殖旺盛，总体数量增多；二是细胞个体的胶原等细胞外基质的生成能力提高，并沉积于肝脏而形成肝纤维化。因此，星状细胞是肝纤维化发生发展的细胞学基础，抑制肝星状细胞活化是抗肝纤维化的重要环节。“药有个性之特长，方有合群之妙用”。既往研究证实扶正化瘀319方有抑制肝星状细胞活化、抗肝纤维化的良好作用，但在影响细胞活化的增殖与胶原生成等环节中，不同治法的药物有何作用特点？药物配伍后会发生什么变化？本文从组方的两类不同治法功效的基本药物组－扶正化瘀及其基本药物组的主要药物配伍等两个层次进行拆方配伍，体外试验发现，化瘀组抑制星状细胞增殖作用增强，使细胞总体数量减少，α-SMA表达也减少。而扶正药则主要作用在细胞个体的胶原基因表达与蛋白生成功能之环节，两组之主药丹参与虫草合用，或两组药物组合成全方后，对细胞增殖与胶原生成的作用均有改变，而位于扶正与化瘀组单独的作用之间。整体试验以全方减轻胶原生成作用最好，这可能因为体内Hyp生成及其胶原沉积是星状细胞增殖与胶原合成等功能变化的综合结果。这种组方配伍的综合作用，一方面可减轻某些药物配伍的强烈作用，防治可能出现的副作用，体现攻补兼施、扶正驱邪的效果；另一方面发挥组方间的优势互补，在多环节多位点起作用。至于其配伍交化的化学物质基础，则需进一步研究，此外本实验也说明，体外血清药理学方法与整体实验结果趋势大致一致，可在一定程度上反映出复方及其配伍在人体内的药效作用，进一步证实扶正化瘀方抗肝纤维化的主要作用机理在于抑制肝星状细胞的增殖与胶原基因的表达。（中医杂志，2000，41．10）