扶正化瘀方促进二甲基亚硝胺肝纤维化大鼠肝窦毛细血管化逆转作
用的实验研究
陆 雄 刘 平 刘成海 徐光福 李风华 顾宏图 刘 成
[摘要] 目的：探讨临床有效的抗肝纤维化扶正化瘀319方（下称319方）对肝纤维化、肝硬化常见病理变化肝窦毛细血管化的逆转作用。方法：采用二甲基亚硝胺（DMN）4周12次腹腔注射制备大鼠肝纤维化模型。造模成型后分为模型对照组与319方治疗组，用药4周；获取血清与肝组织，作病理组织学、电镜超微结构、免疫组化、肝组织羟脯氨酸含量及肝功能测定。结果：正常组大鼠肝窦内皮细胞外周胞浆很薄，有许多小窗孔，内皮下末见基底膜。模型组大鼠肝窦扭曲、狭窄，内皮细胞胞浆窗孔减少成消失，有明显的基底膜出现：肝组织可见出血性坏死，门脉区大量的结缔组织增生，纤维间隔向小时内伸展，肝组织Hyp含量显著增高；肝窦壁Ⅷ因子相关抗原、α-SMA、LM及IV型胶原阳性染色较正常大鼠均显著增强，且范围较广。与模型对照相比较，319方治疗组肝窦扭曲、狭窄程度及内皮窗孔减少和消失程度轻，基底膜较薄成不连续，部分肝窦结构接近正常；肝细胞变性坏死程度轻，肝组织内纤维间隔明显减少，Hyp含量显著降低（P<0.05）；肝窦壁Ⅷ因子相关抗原、α-SMA、LM及Ⅳ型胶原阳性染色均显著减弱，分布面积图像分析结果均显著降低（P<0.05）。结论：扶正化瘀319方可显著促进肝纤维化、肝硬化常见病理变化肝窦毛细血管化的逆转。
材料与方法
1、材料 319方流浸膏，上海中医药大学肝病研究所制备，含生药
2、方法
2．1
动物造模及处理：大鼠36只，体重约
2．2
取材及组织处理：大鼠在称量并记录体重后，乙醚麻醉下开腹，观察腹水的有无，经下腔静脉采血，分离血清；迅即摘取肝脏、脾脏称重，立即取
2．3
血清丙氨酸氨基转移酶活性，赖氏法：血清白蛋白（A1b）含量，溴甲酚绿法：总胆红素含量，卫生部临床检验中心推荐方法（J-P）法，均采用卫生部上海生物制品研究所生产的试剂盒测定。血清透明质酸（HA）含量测定，采用上海海军医学研究所生产的试剂盒测定。
2．4
肝组织轻羟脯氨酸（Hyp）含量测定：用Jamall氏法。
2．5
肝组织胶原纤维染色（丽春红染色）：石蜡切片常规脱蜡至水→0.5%丽春红，苦味酸染液2分种→纯酒精分化2分钟→脱水、透明，中性树胶封固。胶原纤维增生程度半定量标准：0级：正常肝脏，无明显胶原纤维增生；1级：胶原纤维增生，中央静脉和门脉区有少量星状胶原纤维束放散，但无间隔形成；2级：胶原纤维增生，中央静脉和门脉区结缔组织变厚，由此向四周伸出纤维索，形成不完全间隔；3级：原纤维大量增生，有个别菲薄的完全间隔形成；或较厚的不完全间隔即将形成假小叶；4级：完全间隔较厚，假小叶大量形成。
2．6免疫组化染色：envision 试剂两步法。参照文献，制定肝窦壁免疫组化半定量判断标准。0级，阴性；1级，微弱，可疑阳性；2级，弱，少量散在，高倍镜下明确阳性：3级，中等，低陪镜下明确阳性；4级，强，阳性灶分布广泛；5级，很强，阳性灶连结成片，着色强烈。采用HPLAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统。免疫组化染色切片每组各取3张，随机选择3个不同视野，在20×10放大倍数下，测定标准初量窗口（7.04E+004）中肝窦壁阳性区域的面积比。
2．7
统计学方法：计量资料用计算机统计SPSS10.0中ANOVA程序进行单因素方差分析，并用LSD法进行两两比较；计数资料用Ridit分析法。
结 果
3．1各组大鼠肝脏大体观察及大鼠腹水率、死亡率情况比较：
大鼠在造模过程中，体重增长明显抑制，停止造模分组治疗后，各组体重均有增加，但无统计学差异。肝/体重指数方面，三组相比皆无显著差异。脾/体重指数方面，模型组及319方组均显著高于正常组。从死亡情况看，模型组及319组均有2只大鼠死亡。模型组及319方组分别有4只和3只出现腹水，见表1。
3．2各组血清ALT、AST活性、总胆红素及A1b比含量的变化：
模型组血清ALT、AST活性及胆红素含量显著高于正常组，319方组显著低于模型组相，三者间差异均有显著性（P<0.05）。模型组的A1b比含量显著低于正常组，319方组显著高于模型组，三者间差异均有显著性（P<0.05）。见表2。
3．3
各组肝组织Hyp含量的变化：
以每克湿重肝组织所含Hyp计，模型组明显高于正常组，而319方组显著低于模型组，见表2。
3．4 各组血清HA含量的变化：模型组血清HA含量显著高于正常组，而319方组较模型组显著降低，见表2。
表1 各组死亡率、腹水率及肝、脾、体重情况比较（
±s）
|
组别 |
n |
死亡数/总数 |
腹水（只%） |
体重（g） |
肝/体重（%） |
脾/体重（%） |
|
正常组 |
7 |
0 |
0 |
48.6±31.6 |
3.06±0.18 |
2.07±0.34 |
|
模型组 |
11 |
2/13 |
4（36.4） |
334.1±33.0 |
3.70±0.30 |
3.70±0.73* |
|
319方组 |
14 |
2/16 |
3（21.4） |
321.1±55.2 |
3.45±0.55 |
3.33±0.85* |
*与正常组比较，P<0.01
表2各组血清ALT、AST活性、A1b、总胆红素、HA及肝组织Hyp含量比较（±s）
|
组别 |
n |
ALT(U) |
AST |
A1b(g/m) |
胆红素（mg/d1） |
HA(ng/ml) |
Hyp（µg/g湿重肝） |
|
正常组 |
71 |
15.22±5.54 |
132.3±15.14 |
40.31±2.67 |
0.30±0.04 |
102.20±12.6 |
112.37±11.93 |
|
模型组 |
11 |
86.66±20.20* |
207.84±21.40* |
28.88±1.76* |
0.67±0.19* |
154.34±42.69 |
292.83±36.78* |
|
319方组 |
14 |
34.75±13.53△ |
164.90±20.20 |
31.61±2.52△ |
0.47±0.14 |
111.75±32.65△ |
215.03±75.46△ |
与正常组比较*P<0.05；与模型相比较，△P<0.05
3．5
各组肝组织病理变化
3．5．1 HE染色标本观察
正常组大鼠肝细胞束排列整齐，细胞呈立方形，无变性，坏死改变，肝实质内未见炎细胞浸润。模型组大鼠肝组织可见出血性坏死，个别肝细胞水样变性，并可见炎细胞浸润，门脉区有大量的结缔组织增生，可见纤维间隔向小叶内伸展；319方组大鼠肝细胞变性坏死程度较对照组轻，肝组织内结缔组织丧生改善较为明显。在胶原纤维染色切片观察到，模型对照组大鼠胶原纤维增生明显，319方组胶原增生程度显著轻于模型组（p<0.05）。见表3。
3．5．2 肝窦壁第Ⅷ因子相关抗原，层粘连蛋白，Ⅳ型胶原及α-SMA免疫组化观察：
第Ⅷ因子相关抗原阴性对照染色未见非特异性阳性灶。正常组大鼠阳性灶仅出现于中央静脉和汇管区血管壁，肝窦壁未见阳性灶。模型组阳性染色除出现在中央静脉和汇管区血管壁外，较多肝窦壁被染成黄褐色，且范围较广。319方组大鼠肝窦壁vWF阳性范围轻于模型组，图像定量分析显示，319方组肝窦壁阳性面积比明显少于模型组（p<0.05），见表4。层粘连蛋白阴性对照染色未见非特异性阳性灶。正常大鼠肝脏中LM主要分布在血管和胆管的基膜处，肝窦壁仅呈不连续弱阳性，汇管区基质为阴性。模型组大鼠肝窦壁LM的阳性染色显著增强，分布范围也较广。319方组大鼠肝窦壁LM的阳性程度与模型组比较有所减轻，图像定量分析显示，治疗组肝窦壁阳性面积比明显少于模型组（p<0.05），见表4。
Ⅳ型胶原空白对照染色未见非特异性阳性灶。正常大鼠肝脏中Ⅴ型胶原主要分布在血管和胆管的基底膜处，肝窦壁周围也有较多分布，呈连续线状阳性。模型组大鼠除纤维间隔中有阳性表达外，肝窦壁Ⅳ型胶原阳性染色也有所增强，线状阳性明显增粗。319方组肝窦壁Ⅳ型胶原阳性程度有所减轻，图像定量分析显示治疗组肝窦壁阳性面积比明显少于模型组（p<0.05），见表4。
α-SMA空白对照染色未见非特异性阳性灶。正常鼠肝除汇管区血管壁显示。α-SMA阳性外，肝小叶内未见阳性反应。模型组大鼠除纤维间隔中有大量阳性表达外，肝窦壁α-SMA的阳性染色也显著增强，319方组大鼠肝血窦壁阳性反应减弱，图像定量分析显示、治疗组肝窦壁阳性面积比明显少于模型组（p<0.05），见表4。
3．5．3肝组织超微结构观察结果：
正常组大鼠肝窦内皮细胞外周胞浆很簿，有许多小窗孔，内皮下未见基底膜，模型组大鼠表现为肝窦扭曲、狭窄，内皮细胞胞浆窗孔减少或消失，有程度不等的基底膜出现。319方组肝窦扭曲、狭窄程度有所减轻，内皮窗孔减少和消失程度较模型组轻，基底膜较薄或不连续，有的肝窦结构接近正常。
表3 各组胶原纤维增生程度比较（只）
|
组别（n） |
肝脏胶原纤维增生程度 |
||||
|
|
0 |
+ |
++ |
+++ |
++++ |
|
正常组（7） |
7 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
模型组（11） |
0 |
1 |
1 |
4 |
5 |
|
治疗组（14） |
0 |
0 |
8 |
4 |
2 |
表4 各组大鼠肝窦壁vwF、LM、Co1Ⅳ、α-SMA阳性面积比的比较（±s）
|
组别（n） |
vwf |
LM |
ColⅣ |
α-SMA |
|
正常组（7） |
0.03±0.01 |
0.32±0.14 |
5.40±0.51 |
0.65±0.10 |
|
模型组（11） |
2.07±0.98* |
4.51±1.26* |
7.21±1.17* |
3.76±0.91* |
|
治疗组（14） |
1.14±0.92△ |
3.50±1.07△ |
6.15±1.08 |
2.570.80△ |
与正常组比较*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05
讨 论
近来，有学者通过对肝纤维化病人血液流变学的研究，明确提出血瘀表现在慢性肝病病理上即是肝纤维化的形成，肝纤维化是肝病血瘀症侯产生的直接原因。慢性肝病血瘀证患者血中LM、HA含量显著高于正常人和非血瘀证者。第Ⅷ因子相关抗原升高也和血瘀证有一定关系。本实验的动态研究部分提示，LM、HA、第Ⅷ因子相关抗原是反映肝窦毛细血管化的几个重要客观指标。肝窦毛细血管化时肝窦结构常发生改变，例如肝窦扭曲、肝窦壁增厚等，这些病理改变均可直接影响肝脏微循环及门脉压力。肝纤维化时门静脉压力的高低与肝窦毛细血管化而不是与肝纤维化本身直接相关，肝窦毛细血管化的主要病理生理意义就在于破坏了肝窦壁正常结构使肝内微循环发生障碍，从而减弱了肝细胞和血液之间的氧和营养物质的交换。提示肝窦毛细血管化可能是肝纤维化时肝络瘀阻的主要病理组织学基础。
扶正化瘀方对肝纤维化过程中肝窦毛细血管化的逆转作用：扶正化瘀319方是针对肝纤维化的基本病机“血瘀”和“正气虚损”而研制的新一代抗肝纤维化中药复方。多年来临床及体内外实验研究表明，319方有良好的抗肝纤维化作用。本实验采用DMN纤维化模型，进一步观察了扶正化瘀方抗肝纤维化的作用，结果显示，319方能显著降低DMN模型大鼠血液ALT、AST活性及总胆红素含量水平，提高肝细胞合成白蛋白的能力，降低肝组织Hyp含量。病理组织学观察同样显示该方能减轻肝内胶原的沉积。表明扶正化瘀319方抗肝纤维化作用明确，具有良好的可重复性和可信性。
肝窦毛细血管化是肝纤维化过程中一个重要的病理改变，肝窦内皮细胞失窗孔及内皮下基底膜的形成是肝窦毛细血管化的两个重要标志。目前，有关肝窦毛细血管化与肝纤维化关系的研究大多集中在肝窦壁基底膜形成后阻碍了肝细胞和disse间隙的物质交换，导致肝细胞受损，促进肝维化形成；扶正化瘀319方抗肝纤维的特点是多环节，多途径作用于胶原合成及降解的许多途径。但其是否能作用于肝窦毛细血管化，改善肝细胞的营养及血液供应，阻止肝细胞进一步受损从而防止肝纤维化向肝硬化发展还不得而知。本研究组织学观察发现319方能显著改善DMN肝纤维化模型肝窦扭曲、闭塞等形态学变化，电镜超微结构观察也证实了药物能明显促进DMN肝纤维化过程中肝窦内皮的失窗孔及内皮下基底膜的逆转，免疫组化结果也显示，319方组肝窦壁第Ⅷ因子相关抗原、层粘蛋白、Ⅳ型胶原蛋白及α-SMA的表达明显下降，动态研究部分证实了以上指标均在一定程度上反映了肝窦毛细血管化的程度，另外，反映肝窦内皮功能的血清透明质酸含量测定也提示319方有抗肝窦毛细血管化的作用，充分表明319方能显著促进肝纤维化、肝硬化常见病理变化肝窦毛细血管化的逆转。
在DMN肝损伤模型中，当造模停止后，肝窦毛细血管化有自动逆转的倾向，而肝纤维化的自愈倾向在观察的24周内尚不明显，我们认为，扶正化瘀319方促进肝窦毛细血管化逆转的主要意义在于改善了肝细胞与肝窦之间的物质交换，逐渐恢复了肝细胞周围的细胞外基质的微环境，削弱了一些有害因子对肝细胞的连续损伤，从而有效预防了肝纤维化的向肝硬化发展。（中医杂志，2003，44（2）：136-139）